?ImageJ 基础设置?
ImageJ 基于 Java 开发，能在 Windows、Mac 和 Linux 等多种操作系统上运行。打开 ImageJ 软件后，咱们先来熟悉下它的界面。菜单栏包含了各种功能选项，像文件的打开、保存，图像的处理、分析等操作都能在这里找到。工具栏则提供了一些常用工具，比如选择工具、画笔工具等，方便我们对图像进行直接操作。
在进行细胞分析前，得对 ImageJ 进行一些初始设置。点击 “Process” 菜单，选择 “Binary”，再点击 “Options”。在这里，我们可以设置二值化的相关参数，比如避免二值化后出现 Inverting LUT 的情况，这样能防止混淆物体和背景，让后续的细胞分析更准确。
?导入细胞图像?
准备好要分析的细胞图像啦，这些图像格式得是 ImageJ 支持的，像 TIFF、PNG、JPEG、BMP、DICOM、FITS 等都没问题。导入图像的方法很简单，点击 “File” 菜单，选择 “Open”，然后在文件浏览器里找到你的细胞图像，选中并打开就行。要是你觉得这样操作麻烦，还有个更便捷的方法，直接把图片拖动到 ImageJ 的菜单栏，图像就会自动加载进来，是不是很方便！
假设我们要分析的是 DAPI 染色的细胞核图像，导入图像后，就能在 ImageJ 界面看到细胞图像啦。这时候，可别急着进行下一步分析，我们还得对图像做些预处理，让它更适合后续的操作。
?图像类型转换?
一般来说，我们导入的细胞图像可能是 RGB 格式的。RGB 格式的图像通过红、绿、蓝三个通道的叠加来呈现各种颜色，在 ImageJ 里，每个通道支持 8-bit，也就是有 256 级亮度，用数字从 0 到 255 表示，0 是最弱亮度，255 是最亮。但在进行细胞分析时，我们可能需要把它转换为更便于处理的格式。
点击 “Image” 菜单，选择 “Type”，再选择 “8-bit”，就能把 RGB 图像转换为 8-bit 灰度图像。转换公式就是：灰色 =（红色 + 绿色 + 蓝色）/ 3 。不过呢，如果你的图像在保存时已经是单通道的 8-bit 或者 16-bit 格式，那就不需要进行这一步操作啦，毕竟 16-bit 的图像可以直接进行 Threshold，转成 8-bit 反而可能会损失亮度信息。
?调整阈值分割细胞?
接下来这步很关键，要通过调整阈值来分割出细胞。点击 “Image” 菜单，选择 “Adjust”，再点击 “Threshold”，就会弹出阈值设置窗口。
阈值的原理其实不难理解，就是利用细胞和背景信号强度的差异，通过设置只选中 pixel value 在一定范围内的 pixel，来把细胞从背景中分割出来。在设置阈值时，建议选择用红色来表征，这样变为红色的区域就是选中的区域。这里还有个小细节要注意，如果你的图像背景是黑色的，一定要勾选 “Dark Background” 选项哦。
调整阈值的时候，可能会遇到一些情况。要是图像带有比例尺，我们可以拖动调节阈值的上限，把比例尺去除，不然自动计数的时候，软件可能会把比例尺也当成细胞统计进去，所以成像的时候最好别把比例尺印在图像上。要是自动阈值的效果不太好，那就拖动调节阈值的下限，增加选中区域，但要保证在选中细胞核的同时，尽量减少背景的干扰。调整好后，点击 “Apply”，图片就会变成非黑即白的二值化图片啦，白色区域就是我们分割出来的细胞核，它的 pixel value 为 255 。
✨填补细胞空隙✨
经过阈值分割后，得到的细胞图像可能并不完美。有些细胞核存在亮度不均匀的部分，在阈值分割时可能没被选中，导致细胞核看起来有空隙。这时候，我们就要对细胞核进行填补空隙的操作。
点击 “Process” 菜单，选择 “Binary”，再点击 “Fill holes”，这样就能把细胞核中的空隙填补上，让细胞核变成实心球形。这一步操作是为了后续进行 watershed 做准备哦，能让我们的细胞分析结果更准确。
?分离重叠细胞?
细胞密度比较大的时候，经常会出现细胞重叠或者贴近的情况，这会影响我们对细胞数量和其他参数的准确分析。别担心，ImageJ 有办法解决这个问题。
点击 “Process” 菜单，选择 “Binary”，再点击 “Watershed”，ImageJ 就会自动把重叠的两个细胞核分离开来。通过这个操作，我们就能更清晰地分辨每个细胞，为后续的自动分析和计数提供更好的基础。你可以仔细观察红框中的结果，看看是不是重叠的细胞都被成功分开啦。
?自动分析与计数细胞?
终于到了自动分析和计数细胞这一步啦。点击 “Analyze” 菜单，选择 “Analyze Particles”，就会弹出 “Analyze Particles” 界面。在这里，我们要根据实际情况设置一些参数。
“Size” 参数很重要，它表示分析颗粒面积的范围，比如设置为 “300-Infinity”，意思就是分析颗粒面积大于 300（单位是 pixel ）一直到无穷大的颗粒，这个数值要根据细胞的实际大小，以及分析结果的好坏来调整。“Circularity” 参数是指圆度，我们可以根据细胞的形状，调整需要的圆度，1.00 表示标准圆。还有个 “Exclude on edges” 选项，如果勾选了，处于图像边缘的颗粒就不会被计入分析结果。
设置完成后，点击 “OK”，ImageJ 就会自动对细胞进行分析和计数啦。结果会显示出来，比如统计出的细胞核数，以及每个细胞核的面积等信息都会在 “Results” 中展示。这时候，我们可以放大检查原图，看看有没有多数或者漏数的细胞，确保分析结果的准确性。
?其他细胞分析功能?
除了上面讲的细胞计数，ImageJ 还有很多其他实用的细胞分析功能。比如说，我们可以利用它测量细胞的大小、周长、长轴、短轴等几何特征。先使用选择工具选中要测量的细胞区域，然后点击 “Analyze” 菜单，选择 “Measure”，ImageJ 就会给出相应的测量数据。
在分析荧光图像时，ImageJ 能计算荧光强度。通过设置合适的阈值，选中荧光区域，再利用 “Analyze” 菜单下的相关功能，就能得到荧光强度的数值，这对研究细胞的生理状态等很有帮助。而且，ImageJ 还支持对细胞进行形态学分析，像判断细胞的形状是圆形、椭圆形还是其他不规则形状，这对于研究细胞的分化、病变等过程都有着重要意义。
?使用插件拓展功能?
ImageJ 强大的地方还在于它支持插件扩展，通过安装不同的插件，我们能让 ImageJ 实现更多高级功能。比如说，Fiji 插件就为 ImageJ 增加了很多更复杂的生物医学图像分析功能，它遵循 “Just Works” 原则，包含了进行复杂图像分析所需的各种工具。
要安装插件也不难，点击 “Plugins” 菜单，选择 “Plugin Manager”，在弹出的窗口里，我们可以看到各种插件的列表。找到想要安装的插件，勾选它，然后点击 “Install”，ImageJ 就会自动下载并安装插件。安装完成后，重启 ImageJ，就能在相应的菜单或者工具栏中找到新安装插件的功能啦，利用这些插件，我们能对细胞图像进行更深入、更专业的分析。
?批量处理细胞图像?
要是我们有大量的细胞图像需要分析，一张一张手动处理可太耗费时间和精力了。别担心，ImageJ 支持批量处理图像，能大大提高我们的工作效率。
我们得先准备好一个包含所有要处理图像的文件夹，并且确保这些图像的格式和要进行的分析操作是一致的。然后，点击 “File” 菜单，选择 “Import”，再选择 “Image Sequence”，在弹出的文件浏览器中，选中刚才准备好的文件夹，点击 “Open”。ImageJ 会自动识别文件夹中的所有图像，并将它们按顺序导入。
接下来，我们要录制一个宏，把对一张图像进行的分析操作步骤记录下来。点击 “Plugins” 菜单，选择 “Macros”，再选择 “Record...”，这时候，ImageJ 就开始录制我们的操作了。按照前面讲的细胞分析步骤，对导入的第一张图像进行完整的分析操作，操作完成后，点击 “Plugins” 菜单，选择 “Macros”，再选择 “Stop”，宏就录制好了。
最后，点击 “Plugins” 菜单，选择 “Macros”，再选择 “Run...”，在弹出的窗口中，选择刚才录制好的宏，点击 “Run”，ImageJ 就会按照宏中记录的操作步骤，对文件夹中的所有图像进行批量处理啦。处理完成后，我们就能在指定的文件夹中找到所有分析好的图像和结果数据。
?保存与导出分析结果?
完成细胞分析后，别忘了把重要的分析结果保存下来。ImageJ 支持多种格式保存图像和数据。对于处理后的细胞图像，点击 “File” 菜单，选择 “Save As”，然后根据自己的需求选择合适的图像格式，像 TIFF、PNG 等都是常用的格式。
分析得到的数据，比如细胞数量、大小、荧光强度等，一般会显示在 “Results” 窗口中。我们可以直接在这个窗口中复制数据，粘贴到 Excel 等表格软件中进行进一步的整理和分析。要是想把 “Results” 窗口中的数据保存为文件，点击 “Results” 窗口的 “File” 菜单，选择 “Save As”，选择合适的文件格式，比如文本文件（.txt）或者 CSV 文件，保存就行，这样方便后续的数据处理和报告撰写。
ImageJ 作为一款强大的开源图像处理软件，在细胞分析方面有着丰富的功能和便捷的操作流程。从基础的图像导入、类型转换，到复杂的阈值分割、细胞计数，再到利用插件拓展功能和批量处理图像，它为生物医学研究人员提供了全面的细胞分析解决方案。希望大家通过这篇指南，能熟练掌握 ImageJ 进行细胞分析的方法，在科研工作中取得更好的成果！
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